Nuove varietà

Al fine di raggiungere gli obiettivi fissati nei programmi di miglioramento genetico, si possono attuare diverse strategie: il breeding tradizionale integrato o no da tecniche che si basano su l’uso delle biotecnologie legate allo studio degli acidi nucleici (DNA ed RNA) e la mutagenesi indotta.

1. Selezione genealogica

L’attività di costituzione varietale prevede l’incrocio di parentali aventi caratteristiche di interesse al fine di introdurli nella loro progenie.

Dopo l’incrocio, la progenie viene allevata e tramite selezione dei caratteri fenotipici, vengono scelti i genotipi che rispondono alle caratteristiche desiderate. L’attività di selezione viene svolta ad ogni generazione fino ad ottenere una linea pura avente caratteri innovativi di interesse. L’ultima fase della selezione prevede delle prove di tipo agronomico al fine di valutare la produttività della linea su superfici maggiori situate nei diversi areali di coltivazione. Superata quest’ultima fase, si procede all’iscrizione al Registro Italiano delle Varietà di riso prima del rilascio della varietà.

2. Breeding moderno: Selezione Assistita con marcatori Molecolari.

2.1. Reincrocio assistito da Marcatori.

Diverse sono le applicazioni dei marcatori molecolari nelle tecniche di breeding, la più promettente per lo sviluppo di varietà si chiama Selezione Assistita da marcatori molecolari (SAM) e si riferisce all'uso di marcatori molecolari che sono strettamente legati ai loci bersaglio, sostituendo o quale supporto allo screening fenotipico. Identificando un marcatore del DNA associato all’allele di interesse (dominante o recessivo), le piante che possiedono particolari geni possono essere caratterizzate in base al loro genotipo piuttosto che al loro fenotipo.

Esistono tre livelli di selezione in cui i marcatori possono essere applicati nei programmi di breeding che prevedono il reincrocio. Nel primo livello, i marcatori possono essere usati per lo screening per il carattere di interesse, e risultano utili per caratteri che richiedono laboriose procedure di screening fenotipico o che presentano alleli recessivi (non espressi fenotipicamente). Il secondo livello implica la selezione di progenie di reincrocio aventi il gene bersaglio, con dei marcatori molecolari fiancheggianti e strettamente collegati a tale gene cosi da minimizzare i fenomeni di crossing-over. Il terzo livello di breeding assistito con i marcatori molecolari (BAM) comporta la selezione di progenie backcross (che sono già state selezionate per il gene di interesse) con marcatori 'background'. In altre parole, i marcatori possono essere utilizzati per selezionare contro il genoma donatore, accelerando il recupero del genoma parentale ricorrente. Con il reincrocio convenzionale, servono da cinque a sei generazioni per il recupero del parentale ricorrente, mentre con il BAM si possono risparmiare da due a quattro generazioni di reincrocio (Figura 1).

Figura 1. Principio della Selezione Assistita con i marcatori Molecolari.

2.2. Gene pyramiding

Il “gene-pyramiding” è il processo di combinazione simultanea di più geni in un singolo genotipo. Ciò è possibile attraverso il breeding convenzionale, ma estremamente difficile o impossibile nelle prime fasi della selezione. Attraverso l’uso della selezione fenotipica tradizionale, ogni genotipo deve essere fenotipicamente valutato per tutti i caratteri ricercati. Pertanto, può essere molto difficile verificare la presenza del carattere di interesse in certe popolazioni (ad esempio F2) soprattutto se il carattere è recessivo o se l’analisi del carattere di interesse prevede la distruzione del materiale genetico in osservazione. I marcatori molecolari possono facilitare la selezione in quanto i saggi molecolari non risultano distruttivi, richiedono poco materiale vegetale e da un singolo campione di DNA possono essere effettuati molteplici saggi di ricerca di diversi geni di interesse senza attuare nessuna analisi di fenotipizzazione. L'applicazione più diffusa per il “gene pyramiding” è stata quella per la combinazione di molteplici geni di resistenza alle malattie, al fine di sviluppare una resistenza duratura ed ad ampio spettro alle malattia.

2.3. Selezione assistita nelle generazioni precoci

Una delle fasi migliori per l’utilizzo di marcatori molecolari per la selezione è nelle prime generazioni (F2, F3 o F4). Il vantaggio principale deriva dal fatto che molti genotipi aventi caratteri (geni) indesiderati, come ad esempio la suscettibilità a certe malattie, possono essere immediatamente scartati.

Ciò ha importanti conseguenze nelle ultime fasi dei programmi di breeding in quanto la valutazione per gli altri caratteri di interesse può essere più efficiente ed economica, essendo progettata per meno linee di allevamento (soprattutto in termini di superfici in campo).

La Selezione Assistita da marcatori Molecolari può aumentare notevolmente l'efficienza e l'efficacia del breeding rispetto a quello tradizionale; i vantaggi fondamentali della SAM rispetto alla selezione fenotipica tradizionale sono i seguenti:

• la selezione può essere effettuata allo stadio di plantula o di seme, non necessita di grandi quantità di materiale (evitando la distruzione del materiale genetico in osservazione) e la ricerca del carattere di interesse è indipendente del materiale prelevato; inoltre, con poca quantità di materiale di partenza, si possono effettuare molteplici analisi molecolari,
• accelerazione dei tempi di selezione varietale, 
• la caratterizzazione molecolare è più sicura e facile rispetto allo screening fenotipico e le piante singole possono essere selezionate con elevata affidabilità,
• non vi è nessuna interferenza tra il genotipo e l’ambiente, permettendo di selezionare direttamente il carattere di interesse
• selezione mirata e continuata dei genotipi, senza l’eliminazione di quelli che presentano il carattere in eterozigosi che possono essere conservati ed allevati fino al raggiungimento dell’omozigosi.

Tali vantaggi si possono tradurre sia in termini di una maggiore efficienza sia di uno sviluppo accelerato di linee nei programmi di breeding. I test molecolari possono portare ad esempio ad un risparmio di tempo e di lavoro e possono evitare di effettuare prove in campo difficili o che devono essere realizzati in particolari periodi dell'anno o in luoghi specifici e/o in determinate condizioni, o che risultano tecnicamente complicati. Inoltre, la selezione sulla base di marcatori legati al DNA può essere più affidabile in quanto non esiste il fenomeno dell’influenza dei fattori ambientali sulle prove in campo. Inoltre utilizzare marcatori molecolari può essere più conveniente rispetto all’osservazione fenotipica del carattere di interesse. Un altro vantaggio nell’utilizzo della SAM è che il numero totale di linee che devono essere valutate può essere ridotto. Poiché molte linee possono essere scartate dopo la SAM allo stadio di generazione precoce (F3, F4), viene consentita una progettazione più efficace dei programmi di allevamento.

La maggiore efficienza di selezione del carattere target potrebbe consentire ad alcuni caratteri di essere velocemente rintracciati, in quanto specifici genotipi possono essere facilmente individuati e selezionati. Inoltre, i marcatori 'background' possono essere utilizzati anche per accelerare il recupero dei genitori ricorrenti durante il reincrocio assistito con marcatori molecolari.

3. Mutagenesi indotta

Oltre alla valutazione della presenza di mutazioni spontanee nel germoplasma esistente si è fatto ricorso ad una tecnica tradizionale utilizzata già da oltre 50 anni, cioè l’induzione di mutazioni per aumentare la possibilità di ritrovare individui resistenti o tolleranti, avvalendosi di agenti mutageni diversi.

L’induzione di mutazioni con diverse tipologie di agenti mutageni è utilizzata nel mondo per diverse colture erbacee ed arboree. Alla fine del 2000 il numero di varietà mutate era di 2252 (fonte F.A.O.) (www.fao.org), comprese le varietà ottenute da incroci con varietà mutate dove, ovviamente, i cereali rappresentano il gruppo più grande con 1072 varietà.

In Italia sono state già rilasciate 35 varietà ottenute con mutazioni indotte, tra cui 13 di frumento duro (Creso per esempio), 6 di pisello, 2 di frumento tenero, 3 di melanzane, 1 di olivo, 1 di patata e 1 di riso (nel 1973 la varietà Fulgente fu ottenuta trattando il Maratelli con raggi X).

Per quanto riguarda il riso, sempre secondo i dati F.A.O., nel 2000 il numero di varietà di riso mutate era di 434, comprese varietà ottenute da incroci con varietà mutate; queste sono presenti, oltre che in Italia, anche in Asia, negli USA, in Australia, Egitto, Sud-America.

L’esempio più importante di mutazione utile per le varietà di riso è l’identificazione di una singola mutazione nucleotidica del gene sd1-c (sd1-3) nella varietà californiana Calrose 76 (ottenuta trattando la varietà Calrose con raggi gamma). L’effetto di questa mutazione è una variazione della produzione dell’ormone di crescita gibberellina in grado di determinare una riduzione della taglia della pianta. Questa caratteristica è stata utilizzata per l’esecuzione di incroci e programmi di selezione che hanno determinato lo sviluppo di numerose cultivars di riso in tutto il mondo e determinando una vera e propria “green revolution”.

Le mutazioni che permettono di ottenere varietà o ibridi tolleranti sono tutte a carico di alcune sequenze di amminoacidi; le più comuni sostituzioni sono a carico degli amminoacidi Ala122, Pro197, Ala205, Trp574, e Ser653 che codificano per l'enzima acetolattato sintetasi. In particolare la mutazione nei codoni 205, 653 e 654 conferiscono la tolleranza agli imidazolinoni.

Considerando che questa caratteristica sia stata ottenuta mediante selezione e miglioramento genetico di tipo tradizionale partendo da linee derivate da mutagenesi indotte rende universalmente riconosciuto che non si tratti di varietà OGM (transgeniche) in quanto nessun gene, o parte di DNA, di un altro organismo è stato inserito nel genoma di queste varietà. In riferimento alle restrizioni alla commercializzazione ed alla coltivazione di specie vegetali OGM in numerosi paesi del mondo, in particolare Europa e Giappone, lo sviluppo delle varietà IMI-tolleranti ha avuto un notevole incremento ed in prospettiva è prevedibile un loro sempre maggiore impiego.

3.1. La tecnologia Clearfield®

La necessità di avere varietà di riso tolleranti nasce dal fatto che il sistema risaia, a differenza degli altri sistemi colturali, è contraddistinto dalla presenza di un infestante, il riso crodo che presenta caratteristiche genetiche simili alle varietà coltivate. Tale infestante, appartiene allo stesso genere e alla stessa specie del riso coltivato (O. sativa L.) pertanto ha potuto svilupparsi senza particolari problemi nelle risaie italiane risultando insensibile all’attività degli erbicidi selettivi impiegati sul riso.

Non essendo disponibile sul mercato alcun erbicida selettivo per il riso ed efficace per il crodo, si avviò una nuova serie di programmi di miglioramento genetico volti ad ottenere varietà di riso resistenti ad una famiglia di erbicidi. La ricerca iniziò più di vent’anni fa nei centri di ricerca americani (prima nazione a studiare, ottenere e commercializzare tale tecnologia) per ottenere varietà resistenti. I primi studi furono orientati nella ricerca di individui o popolazioni resistenti al glyphosate, metolaclor ed imazethapyr, quest’ultimo dimostrò una notevole efficacia nel controllo della malerba agendo per contatto e manifestando una buona residualità. L’imazethapyr è incluso nel gruppo chimico degli imidazolinoni, una delle famiglie chimiche che portano all’inibizione dell’enzima acetolattato sintetasi (ALS) responsabile della sintesi di amminoacidi a catena ramificata in particolare valina, isoleucina e leucina.

Gli imidazolinoni risultano essere attivi su molte specie di infestanti, sono efficaci a bassi dosaggi, sono poco tossici per gli animali e presentano un favorevole profilo ambientale.

Lo sviluppo di questa tecnologia è cominciata nel 1993, quando il dr. Tim Croughan della Louisiana State University ha identificato una pianta di riso che mostrava una tolleranza agli erbicidi appartenenti alla famiglia chimica degli imidazolinoni. La linea di riso 93-AS-3510 tollerante agli imidazolinoni è stata scoperta attraverso trattamenti su seme appartenenti alla varietà commerciale AS 3510 con etil metil sulfonato (EMS), nota sostanza utilizzata per indurre mutagenesi nei semi impiegata in molti programmi di miglioramento genetico. A partire da quel momento, sono state sviluppate diverse varietà di riso tolleranti agli imidazolinoni; questo risultato è stato possibile attraverso un programma di miglioramento genetico di tipo tradizionale, basato su incroci utilizzando la linea 93-AS-3510 come parentale maschile impollinatore. I programmi di breeding proseguirono e nel 1999 le varietà “CL 121” e “CL 141” furono le prime ad essere ottenute e coltivate, sviluppate utilizzando come parentali la linea 93-AS-3510.

Un’altra varietà tollerante CL 161, attualmente coltivata negli USA ed in altri paesi del mondo, proviene dalla linea CFX 18 che deriva a sua volta da una mutazione avvenuta nella varietà tradizionale ”Cypress” e che presenta una maggiore resistenza all’erbicida specifico rispetto alla varietà 93-AS-3510.

La tolleranza nella varietà CL 161 è determinata da una singola mutazione del gene che codifica per l’AHAS (acetoidrossi acido sintetasi), in particolare la posizione della sostituzione è al codone 653 dove l’amminoacido serina è sostituito con asparagina.

Nel 2003 grazie ad una collaborazione tra Ente Nazionale Risi e BASF Corporation vennero eseguite alcune prove di valutazione in campo della varietà CL161. I risultati soddisfacenti di questa sperimentazione hanno permesso l’avvio dell’iter di iscrizione di questa varietà al Registro Nazionale delle Varietà con la denominazione Libero, permettendo dal 2006 la coltivazione in Italia di varietà tolleranti agli imidazolinoni.

Il panorama varietale italiano vede la presenza di diverse varietà di riso ottenute con tecnologia Clearfield®; l’Ente Nazionale Risi, conducendo mirati programmi di breeding ha ottenuto ed iscritto cinque ulteriori varietà di riso resistenti agli erbicidi imidazolinonici con le seguenti denominazioni: CL71, CL26, CL80, CL12 e CL46.

La ricerca per lo sviluppo di nuove varietà di riso tolleranti a questo principio attivo è tuttora in corso ed è orientata alla costituzione di nuove varietà con caratteristiche migliorate.